В эксперименте технология избирательно уничтожила злокачественные и инфицированные вирусом клетки.
Группа исследователей из США и Германии провела серию опытов на культурах клеток, показав, что недавно выявленная нуклеаза Cas12a2 в системе CRISPR-Cas способна избирательно ликвидировать определённые типы эукариотических клеток, будь то паразитические, опухолевые или заражённые вирусом, путём фрагментирования их ДНК.
Соответствующий отчет опубликован в журнале Nature.Селективное уничтожение клеток по их генетическим или физиологическим характеристикам может помочь в борьбе с патологическими клетками, патогенами и формировании специфических клеточных сообществ. На данный момент инструменты вроде ингибиторов, токсинов, антител и модифицированных иммунных клеток не обладают достаточной специфичностью и не могут нацеливаться на произвольные генетические маркеры. Обычная система CRISPR-Cas традиционно редактирует геном, вызывая точечные разрывы ДНК, но не уничтожает саму клетку.
В 2023 году сотрудники Центра имени Гельмгольца по исследованию инфекций и Университета Юты описали механизм действия Cas12a2 — уникальной нуклеазы системы CRISPR-CasV типа. Она распознаёт специфическую РНК-последовательность в бактериальной клетке и запускает широкомасштабное и неразборчивое разрушение одноцепочечной РНК и ДНК, а также двухцепочечной ДНК, что приостанавливает клеточный цикл и вызывает SOS-ответ. До настоящего времени эффекты Cas12a2 в эукариотах оставались неизученными.
В рамках эксперимента Ян Лю из Университета Юты и команда, а также созданная ими компания Akribion Therapeutics, использовали два близких варианта Cas12a2: из бактерии Sulfuricurvum sp. PC08-66 (SuCas12a2) и из метагеномного образца (GeCas12a2) — с идентичностью 89% и схожими биохимическими свойствами. На дрожжах Saccharomyces cerevisiae с активным и инактивированным геном ADE2 система CRISPR-Cas с GeCas12a2, нацеленной на транскрипт ADE2, сократила количество клеток с активным геном в 134 раза по сравнению с контролем без признаков репарации ДНК, тогда как SuCas12a2 снизила число клеток в 4 раза с репарацией у 90% клеток.
Аналогичные результаты подтвердились на человеческих клеточных линиях с разным уровнем трансгенов и естественных транскриптов. Механизм действия Cas12a2 связан с масштабным разрушением двухцепочечной ДНК, приводящим к апоптозу и в меньшей степени — некрозу или воспалению с лизисом. Минимальные несовпадения комплементарности не вызвали ненамеренной активации Cas12a2 ни у дрожжей, ни у человеческих клеток, о чём свидетельствуют данные ДНК-баркодинга и РНК-секвенирования.
Для оценки потенциала лечения хронических вирусных инфекций учёные разработали гидовую РНК, направленную на транскрипты белков E6 и E7 возбудителя — онкогенного вируса папилломы человека (ВПЧ). Введение GeCas12a2 и соответствующей гидовой РНК в культуру инфицированных ВПЧ клеток привело к их уменьшению на 94% по сравнению с незараженными. Кроме того, инъекция липидных наночастиц с E6-гидовой РНК и мРНК GeCas12a2 в мышиную модель с пересаженной плоскоклеточной карциномой с ВПЧ 16 замедлила рост опухоли, что подтверждено гистологически. Через 72 часа после введения в целевых клетках выявлялись маркеры апоптоза.
Далее учёные применили Cas12a2 для обогащения культур клеток с генетическими модификациями. После вызова неспецифических мутаций в гене зелёного флуоресцентного белка с помощью FnCas12a обработка GeCas12a2, нацеленной на неизменённые транскрипты, увеличила частоту мутантных клеток в 3,1 раза. Аналогичный эксперимент с внесением точечных мутаций в ген GAPDH с Cas9 показал четырёхкратный рост числа отредактированных клеток после обработки GeCas12a2.
Исследователи также создали клеточную линию U2OS с онкогенной мутацией KRASG12C и показали, что Cas12a2, направленная на мутантный транскрипт, снижает количество таких клеток на 62%, не затрагивая нормальные. В клетках линии NCI-H23 с мутацией KRASG12C GeCas12a2 уменьшала популяцию на 50%, а совместно с соторасибом — препаратам, нацеленным на ту же мутацию, — до 85%. При этом эффективность нуклеазы сохранялась даже в клетках, устойчивых к препарату.
Таким образом, система CRISPR-Cas с нуклеазой Cas12a2, распознавая заданную РНК-последовательность, дробит ДНК и вызывает гибель клетки, что открывает новые возможности для целенаправленного уничтожения патологических клеток. Однако для применения in vivo требуется решить задачи доставки, повышения эффективности и подтверждения безопасности для здоровых тканей.
Отметим, что ранее американские учёные создали первый нейросетевой инструмент для генерации искусственных систем CRISPR-Cas9. Один из вариантов успешно применили в человеческих клетках, причем по специфичности он превзошёл природную SpCas9, сохранив эффективность.
Новая нуклеаза Cas12a2 в системе CRISPR-Cas убивает заданные клетки разрезанием их ДНК • Опубликовано на FiNE NEWS
Свежие комментарии